Os jogos da série se passam inicialmente em 2012, época em que Desmond Miles, um barman e descendente de uma linhagem da Ordem dos Assassinos, é sequestrado por membros das Indústrias Abstergo - uma fachada para os cavaleiros templários atuais - para descobrir a localização dos Pedaços de Éden, artefatos antigos de grande poder criados por Aqueles Que Nos Precederam. Para isso, Warren Vidic, um empregado da Abstergo, e Lucy Stillman, uma assassina infiltrada, forçam Desmond a usar o Animus, um dispositivo capaz, dentre outras coisas, de criar projeções em três dimensões a partir de memórias de ancestrais contidas no DNA, chamadas na série de memórias genéticas. A partir de tais lembranças, o dispositivo permitia ao paciente revivê-las, conferindo inclusive um controle parcial sobre as cenas, como se estivessem sendo revividas.

No primeiro jogo da série, Desmond vive a vida do sírio Altair , membro de uma Ordem de Assassinos denominada Hashshashin da época daTerceira Cruzada da Terra Santa; e seu principal objetivo é eliminar os membros da Ordem dos Templários, responsáveis pela Terceira Cruzada. Para eliminar certas vítimas, a personagem cruza as cidades de Damasco, Jerusalém e Acre, cumprindo o seu dever no meio de uma guerra secreta.

É possível misturar-se em meio às pessoas comuns das cidades para se camuflar e, assim, passar despercebido por guardas e outros inimigos - um elemento inédito e que caracterizou a jogabilidade da franquia em títulos futuros. Para sua época, os gráficos são além de seu tempo, embora a realização de algumas missões acabe se tornando um tanto repetitiva no decorrer do jogo.

Ao conseguirem a informação desejada pela Abstergo, a morte de Desmond é ordenada, mas, ele é salvo por um pequeno grupo de assassinos, compostos por Lucy Stillman,Shaun Hastings e Rebecca Crane. Com isso, Desmond ajuda os Assassinos na corrida pelos Pedaços do Éden usando novas versões do Animus para fazer uso das memórias do italiano Ezio Auditore da Firenze e do indígena norte-americano Connor Kenway, assassinos do Renascimento e da Revolução Americana, respectivamente, para poder descobrir a localização dos outros artefatos.

Após a morte de Desmond, a série conta a história do galês Edward Kenway, pirata e corsário que viveu na Era Dourada dos Piratas, pai de Haytham Kenway e avô de Ratonhnhakéton (Connor Kenway). Logo após a história de Edward, a franquia nos mostra a história do assassino que se tornou templário Shay Cormac, que nasceu na América Britânica, filho de imigrantes irlandeses, e acompanhou a Guerra dos 7 Anos e se tornou um amigo e aliado de Haytham. No mais recente e último jogo da série conhecemos a história do assassino francês Arno Victor Dorian, que viveu na França durante a Revolução Francesa